שנתיים חלפו מאז שפיטר פארקר (טובי מגוויר, 'סיביסקיט: אגדה אמריקאית', 'תקנות בית השיכר') עזב את אהובת לבו, מרי ג'יין ווטסון (קירסטן דאנסט, 'ראיון עם ערפד'), והחליט לחיות את חייו כספיידרמן. פארקר מנסה לשלב את כוחות העל שקיבל מעקיצת העכביש הרדיואקטיבי והאחריות הכבדה שבאה יחד איתם, ויחד עם חייו כבחור צעיר שמנסה להשלים את לימודי הקולג' שלו, למצוא עבודה ולשלם את שכר הדירה שלו. מרי ג'יין, בינתיים, המשיכה את חייה. היא פצחה בקריירת משחק ויש לה גבר חדש בחיים. מערכת היחסים של פארקר עם חברו הטוב ביותר הארי אוסבורן (ג'יימס פרנקו) נפגעה גם היא, מאז מות אביו של הארי בסרט הראשון, ויצר הנקמה שלו נגד ספיידרמן, אשר גדל וגדל ככל שהימים נוקפים. ואולם, זה לא הכול. חייו של פארקר מסתבכים עוד יותר, כשהוא נאלץ לעמוד אל מול אויב חזק וחדש, דוקטור אוטו אוקטביוס (אלפרד מולינה, 'פרידה'), מדען מטורף וקר לב שלגופו הולחמו ארבע זרועות מכניות.